图 （a）高分辨工程化纳米孔检测RNA表观遗传修饰原理示意图;（b）RNA主要表观遗传修饰的结构及其单分子纳米孔指纹信号；（c）—（e）酵母苯丙氨酸tRNA（tRNAphe）修饰图谱检测

  在国家自然科学基金项目（批准号：21675083、91753108、31972917）等资助下，南京大学化学化工学院黄硕教授团队在RNA表观遗传修饰鉴定方法取得进展。相关研究成果以“利用工程化纳米孔鉴定核糖核苷酸及其表观遗传修饰 （Identification of nucleoside monophosphates and their epigenetic modifications using an engineered nanopore）”为题，于2022年7月18日发表在《自然·纳米技术》（Nature Nanotechnology）杂志上。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41565-022-01169-2。

  RNA表观转录组越来越受到科学家们的重视。迄今为止，在RNA上已经发现170种表观遗传修饰，他们在调节各种生命过程中发挥着至关重要作用，还与癌症、中风等人类疾病的发生密切相关。基于高通量二代测序的分析方法可以得到转录组RNA修饰的图谱，但该方法是利用抗体或化学分析来间接推断RNA修饰类型，但对于每一种修饰都需要开发专用且独特的流程，限制了其广泛应用。

  纳米孔测序为RNA修饰提供了一种无需逆转录的直接测序方法，但受限于有限的孔道分辨率，RNA修饰的读出错误率高，并且容易受到相邻位置的影响。为此南京大学黄硕教授团队构建了一种超高分辨的工程化纳米孔，可以准确地识别所有RNA核苷酸和发生在它们上的主要修饰。研究团队对八聚体耻垢分枝杆菌膜蛋白A （MspA） 纳米孔的其中一个单体理性设计，进而在孔道内最灵敏的识别位点精准引入唯一的苯硼酸适配器 （图a），实现了四种经典核苷酸（C, U, A, G）, 5-甲基胞苷（m5C）， N6 -甲基腺苷（m6A）， N7 -甲基鸟苷（m7G）， N1 -甲基腺苷（m1A），肌苷（I），假尿嘧啶（Ψ）和二氢尿嘧啶（D）的完全区分与同时检测 （图b），机器学习识别准确率高达99.6%。研究团队将该方法运用于天然RNA的表观遗传修饰鉴定，在RNA消化产物中实现了修饰核苷酸的直接定量分析，成功绘制胃肠癌标志物miRNA和酵母tRNA的修饰图谱 （图c—e）。

  该方法适用于大量核苷酸、核苷酸修饰及核苷酸衍生物的检测，为快速定量分析天然RNA中的表观修饰提供高分辨单分子分析工具，并为发展纳米孔RNA表观遗传测序提供了重要的设计策略和研究方法。