子科生物报道：2023年8月，生物治疗国家重点实验室陈强研究员/余雅梅副研究员团队联合苏昭铭研究员团队在The Innovation（IF：32.1）发表文章“DnaQ mediates directional spacer acquisition in the CRISPR?Cas system by a time-dependent mechanism”，揭示DnaQ在CRISPR?Cas系统中的作用提出了由DnaQ介导的“时间依赖”的Spacer整合机制，为基于CRISPR-Cas系统Spacer整合应用发展提供了理论基础。

陈强研究员、余雅梅副研究员、苏昭铭研究员为该文共同通讯作者，我院泌尿外科博士后唐冬梅、生物治疗国家重点实验室博士生贾婷婷、研究助理罗永波、精准医学中心牟必琴实验师为共同第一作者。

由CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）与Cas（CRISPR-associated proteins）两大部分组成的CRISPR-Cas系统是原核生物的获得性免疫系统。当病毒入侵宿主细胞时，原核宿主内部CRISPR-Cas 系统可以将捕获的外源 DNA 片段插入自身基因组的CRISPR 阵列中形成免疫记忆，这些插入片段称为Spacer，随后Spacer被转录加工为crRNA，效应蛋白与crRNA 形成干扰复合物，靶向降解与crRNA碱基互补的外源DNA序列，保护宿主免受病毒侵害。

在Spacer获取阶段，不同类型的CRISPR-Cas系统作用机制较为保守，由Cas1和Cas2形成的六元复合物发挥整合酶功能，特异性识别具有Protospacer Adjacent Motif (PAM)的外源 DNA片段，将捕获的外源DNA片段整合进CRISPR阵列中。该过程必须满足两个关键因素：1）Spacer正确的插入方向，保证对外源基因的正确识别；2）PAM序列在Spacer插入之前被移除，避免自身免疫发生，从而保证该系统准确行使免疫识别及免疫清除功能。目前已知Cas4蛋白可以识别PAM序列，帮助外源DNA片段整合并形成正确免疫记忆。而在不包含Cas4的系统中，DnaQ家族的核酸外切酶执行类似Cas4功能，但具体机制尚不清楚。

为探究DanQ在CRISPR-Cas系统中的作用机制，研究团队选择研究嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）I-E类型 CRISPR-Cas 系统，该系统的特殊之处在于Cas2融合了一个DnaQ结构域。通过异源体内整合实验证实DnaQ可有效提高Spacer整合效率，深度测序分析明确了该系统的PAM序列。通过冷冻电镜（Cryo-EM）技术解析Cas1-Cas2-prespacer复合物结构，从结构角度阐明了该系统中Cas1识别PAM序列的分子机制(图1)。

图1  Cas1-Cas2-prespacer复合物的冷冻电镜结构

研究通过体外酶切实验，发现DnaQ可以将含有PAM和不含PAM的DNA链处理至整合反应的标准长度，但对不含PAM的DNA链的酶切效率明显更高（图2）。这是首次证实DnaQ可在体外切除外源DNA的PAM序列。此外，体外整合实验表明，DnaQ可帮助含有PAM序列的DNA以正确的方向插入CRISPR阵列（图2）。

图2  DnaQ依赖于PAM序列的酶切与Spacer整合机制

文章解析了嗜热链球菌CRISPR-Cas 系统的DnaQ、DnaQ-TMP复合物的晶体结构（分辨率为1.50 ? 和1.45 ?，图3），这是首个与CRISPR-Cas 系统相关的DnaQ高分率结构。根据该结构，研究提出了DnaQ的催化机制。

图3 DnaQ和DnaQ-TMP复合物的晶体结构

综上所述，该研究提出了一个由DnaQ介导的“时间依赖”的不对称整合机制：嗜热链球菌 DnaQ 对于含有PAM一侧DNA的酶切速度明显慢于不含PAM序列的一侧，而先被处理至合适长度的一侧则以“先到先得”的方式先被整合至CRISPR阵列，从而保证Spacer整合的正确方向(图4)。

图4  DnaQ介导的“时间依赖”的Spacer整合机制。含有PAM的DNA片段（携带行李的白色衣服乘客）经过安检门（DnaQ）时，需要将行李（PAM）托运，延迟了登机（整合）时间。不含PAM的DNA片段（不携带行李的黑色衣服乘客）先通过安检门，先一步登机，坐在靠里面的位置，从而决定了乘客的有序排列（Spacer在CRISPR阵列上的正确方向）。

综上，该研究不仅首次报道了CRISPR-Cas系统相关的DnaQ高分率结构，并为DnaQ移除PAM序列提供了直接的实验证据，提出了由DnaQ介导的“时间依赖”的Spacer整合机制，为基于CRISPR-Cas系统Spacer整合的应用（如DNA信息存储器，疾病诊断和环境监测等）的发展提供了理论基础。