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样品收集、处理及保存方法：
1、 血清：操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。
2、 血浆：EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、 细胞上清液：1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、 组织匀浆：将组织加入适量理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。
5、 保存方法：如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
[人25羟基维生素D（25-OH-D）ELISA检测试剂盒]操作注意事项：
1、 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2、 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3、 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4、 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5、 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6、 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
7、加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
8、按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
[人25羟基维生素D（25-OH-D）ELISA检测试剂盒]操作过程主要步骤总结如下：
稀释--加样--温育--配液--洗涤--加酶--温育--洗涤--显色--终止--测定

详细操作步骤如下：
1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.  样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
4.  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

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