子科生物报道：在基因表达分析中，例如RNA-seq（RNA测序），spike-ins被广泛使用。在样本制备的早期阶段将spike-ins加入到样本中。由于这些spike-ins的加入量是已知的，它们可以作为一个内部参照，帮助研究人员校正样本处理和测序过程中可能出现的技术变异，如PCR扩增偏差、RNA降解或测序误差等。

Spike-ins是一种实验室技术，用于在生物学样本中加入已知的、外源的控制分子，以监测和校正实验过程中可能出现的变异和偏差。这些控制分子通常是合成的RNA或DNA片段，它们在序列上与目标生物样本中的自然序列不同，因此不会与样本中的任何自然分子发生混淆。

通过比较spike-ins的预期和实际测序读数，研究人员可以评估和校正样本中其他自然RNA分子的测序数据。这种方法提高了数据的准确性和可重复性，使得对基因表达水平的定量分析更加可靠。

Spike-ins的使用对于确保生物学研究结果的有效性和准确性至关重要，特别是在那些需要精确测量基因表达变化的实验中，如疾病模型、药物筛选、环境刺激响应等研究。通过这种方式，研究人员可以更准确地解释实验结果，从而得出更可靠的科学结论。

现在，研究人员发表了一种简单的技巧，提升了我们理解外部因素（如温度）如何影响植物基因活动的技术的精确度。

“这项研究实际上有两个贡献，”北卡罗来纳州立大学分子与结构生物化学副教授Colleen Doherty表示，她是该研究论文的通讯作者。“首先，我们提高了植物研究界对一个许多人不熟悉的问题的认识，并强调了解决方案的重要性。其次，我们已经证明，解决这个问题可以显著改变我们对植物基因活动的理解。”

RNA-seq分析技术面临的挑战

争议的焦点是一种名为RNA-seq分析的技术，该技术用于测量基因活性的变化——也就是说，当基因活跃地转录以产生蛋白质时。

“我们利用RNA-seq分析来评估植物对各种刺激或环境变化的反应，”Doherty说。“这种技术之所以被广泛使用，是因为它提供了一种相对简单且成本较低的方法来监测植物的反应。”

例如，研究人员可以利用RNA-seq分析来观察植物在干旱条件下哪些基因被激活，进而为培育抗旱新品种提供信息。然而，Doherty和她的合作者偶然发现了与RNA-seq分析相关的一个特殊挑战。

识别并解决问题

Doherty说：“我们在一天中的不同时间监测植物对不同温度的反应，结果却大相径庭。我们最初以为可能是我们做错了什么。但当我们深入研究时，我们了解到在动物和酵母中已知的根据一天中的时间或氮剥夺等因素发生的转录全局变化。”

换句话说，研究人员希望观察特定变量——比如温度升高——是如何影响特定基因转录的。但是，有些变量——比如一天中的时间——可能会增加或减少所有基因的转录。这可能会让研究人员难以就他们想要研究的具体变量得出结论。

DohertyDoherty说：“幸运的是，我们发现在研究非植物物种的学者中，这个问题已经得到了充分认识，他们已经开发出一种称为人工spike-ins的方法来解释它。这些以及类似的技术已经在植物科学的其他背景下使用过。但出于某种原因，当我们采用RNA-seq分析时，我们的领域并没有将人工spike-ins纳入我们的方法中。”

人工spike-ins的影响与潜力

人工spike-ins利用了与植物基因组中任何元素都不同的外源RNA片段，这意味着外源RNA不会与植物自身产生的任何物质混淆。研究人员在实验开始时将外源RNA引入分析过程。由于转录的全局变化不会影响外源RNA，因此它可以作为一个固定的基准，使研究人员能够确定植物自身产生的RNA总体上增加或减少的程度。

Doherty说：“当我们使用人工突变来解释转录的全局变化时，我们发现植物在一天中不同时间暴露于温度变化的差异实际上比我们预期的还要大。人工spike-ins为我们提供了更准确的信息，并让我们更深入地了解了植物在夜间的行为——因为我们发现全球转录在夜间更高。在我们采用人工spike-ins信号之前，我们错过了很多夜间发生的事情。人工spike-insspike-ins是一个优雅的解决方案，我们植物研究界的许多人甚至不知道这个挑战的存在。我们乐观地认为，这项技术将提高在各种可能影响植物物种全局转录的条件下转录分析的准确性。反过来，这可能有助于我们的研究界对我们研究的物种获得新的见解。我们并没有开发这种解决方案——人工spike-ins——但我们真的希望它能在植物科学中得到更广泛的应用。”

“A normalization method that controls for total RNA abundance affects the identification of differentially expressed genes, revealing bias toward morning-expressed responses” by Kanjana Laosuntisuk, Amaranatha Vennapusa, Impa M. Somayanda, Adam R. Leman, SV Krishna Jagadish and Colleen J. Doherty, 30 January 2024, The Plant Journal.